Gegründet wurde das Museum von dem Restaurator und Maler Hannes Köttig. Am 17. September 1959 öffnete es im Isartor. Ganz im Sinne von Karl Valentin verschickte Hannes König zur Eröffnung einen vier Kilo schweren Ziegelstein als Einladungskarte. In den 1970er Jahren wurden die Räumlichkeiten im Zuge einer Sanierung um den Nordturm erweitert. Bis 2018 war das im Isartor untergebrachte Museum privat betrieben. Danach wurde die Sammlung von der Stadt München übernommen, um dessen Erhalt zu sichern.
Seit 2004 ist Sabine Rinberger Direktorin des Valentin-Karlstadt-Musäums. Sie konzipierte die Dauerausstellung neu. Gezeigt werden sowohl das künstlerische Schaffen als auch sein Privatleben. Karl Valentin war ein wahrliches Multitalent. Unter anderem war er Komiker, Stückeschreiber, Schauspieler, Filmemacher, Volkssänger und Avantgardist. Seiner Bühnenpartnerin Liesl Karlstadt, die einen großen Beitrag zu seiner Kunst geleistet hat, wurde 2001 unter Gudrun Köhl ein eigenen Raum eingerichtet. Demzufolge wurde der Name auch in Valentin-Karlstadt-Musäum umbenannt. Parallel wurde mit dem Kino auch ein Platz geschaffen, wo die Filme der beiden gezeigt werden. Seit 2007 beherbergt das Museum zudem eine allgemeine Ausstellung zu den bayerischen Volkssängerinnen. Als Highlight der Sammlung ist unter anderem der pelzbesetzte Winterzahnstocher oder das Telefon des Buchbinder Wanningers hervorzuheben.
Im Museum ist ein Café untergebracht, das sogenannte Turmstüberl. Es ist urig eingerichtet. Pate dafür könnte die Ritterspelunke von Karl Valentin gestanden haben, die zugleich Kneipe, Bühne und Kuriositätenkabinett in einem war. Ausgestattet ist das Turmstüberl mit dem Mobiliar des legendären „Café Stefanie“ und des „Café Größenwahn“. Zu den Besonderheiten zählen unter anderem der eiserne Spazierstock des bayrischen Herkules Hans Steyrer.
Da das Museum 2024/25 saniert wird, wird momentan ein Ersatzprogramm gezeigt. Eine sogenannte Hofausstellung mit wetterfesten Plakaten ist vor und im Isartor zu sehen. Ihr Titel lautet „Liesl Karlstadt und Karl Valentin. Durch Nacht und Nebel“ und wird noch bis Ende April 2025 gezeigt. Im Innenhof findet auch die Veranstaltung Jodeln im Tor statt. Die anderen Veranstaltungen wurden ins VS in der Goethestrasse Teile der Sammlung sind auch online einsehbar. Die Wiedereröffnung im Isartor erfolgt voraussichtlich Frühjahr 2026.